* Green Goblin (Norman Osborn) :Dette er hovedskurken og er spillbar fra starten av.
* New Goblin (Harry Osborn) :Du låser opp Harry som en spillbar karakter ved å fullføre spillets historiemodus.
Det er ingen andre spillbare nisser i spillet.
Det er viktig å merke seg at Spider-Man 3 (2007) er et enkeltspillerspill . Det er ingen flerspillermoduser der du kan låse opp nye karakterer.