Han ble født Robert John Wagner, Jr. i Cincinnati, Ohio. Foreldrene hans var Robert John Wagner, Sr., en reisende selger for et farmasøytisk selskap, og Helen (née Hohman) Wagner, som var kontorist i et bakeri. Han hadde en yngre søster, Mary Wagner, og en yngre bror, William John Wagner.
Wagners familie flyttet til Los Angeles da Bob var 12. Han begynte å opptre i en alder av 16, da han ble oppdaget av en talentspeider mens han spilte i et teaterstykke på videregående skole. Han signerte med William Morris Agency og begynte å dukke opp i små roller i filmer og TV-serier.
Wagners store gjennombrudd kom i 1951 da han ble rollebesatt i hovedrollen i filmen «With a Song in My Heart». Han fortsatte med å spille hovedrollen i en rekke suksessrike filmer, inkludert "Stars and Stripes Forever" (1952), "The Band Wagon" (1953), "The Eddie Cantor Story" (1953) og "Deep in My Heart" ( 1954).
Wagners TV-karriere begynte på begynnelsen av 1950-tallet, da han dukket opp i episoder av show som "Lux Video Theatre" og "The Colgate Comedy Hour". Han hadde sin egen TV-serie, "It's Always Jan" (1955–1956), og han spilte også hovedrollen i sitcoms "The Bob Wagner Show" (1957–1958) og "The Robert Wagner Show" (1958–1959).
På 1960-tallet fortsatte Wagner å dukke opp i filmer og TV-serier. Han spilte hovedrollen i filmer som "Sink the Bismarck!" (1960), "The Longest Day" (1962), "The Great Race" (1965) og "Harper" (1966). Han hadde også en tilbakevendende rolle i TV-serien "The Saint" (1962–1969).
På 1970-tallet begynte Wagners karriere å avta. Han dukket opp i færre filmer og TV-serier, og han måtte ofte ta på seg biroller. Imidlertid spilte han hovedrollen i de suksessrike miniseriene "Masada" (1981) og "Sins of the Father" (1984).
På 1980-tallet tok Wagners karriere tilbake. Han spilte hovedrollen i TV-serien "Hart to Hart" (1979–1984) og "Scarecrow and Mrs. King" (1983–1987). Han dukket også opp i en rekke suksessrike filmer, inkludert "Ice Station Zebra" (1968), "The Towering Inferno" (1974) og "The Pink Panther Strikes Again" (1976).
På 1990-tallet fortsatte Wagner å dukke opp i filmer og TV-serier. Han spilte hovedrollen i filmer som "Dragonfly" (2002) og "Austin Powers in Goldmember" (2002). Han hadde også en tilbakevendende rolle i TV-serien "Monk" (2002–2009).
Wagners siste filmopptreden var i 2008-filmen "The Second Chance". Han døde av lungebetennelse 18. mars 2008.
Wagner var gift tre ganger. Han var først gift med skuespillerinnen Natalie Wood fra 1957 til 1962. De hadde en datter sammen, Natasha Gregson Wagner. Han var da gift med skuespillerinnen Marion Marshall fra 1963 til 1970. De hadde to barn sammen, Katie Wagner og Joshua Wagner. Han ble til slutt gift med skuespillerinnen Jill St. John fra 1990 til hans død i 2008.
Wagner var en suksessfull skuespiller med en karriere som strakte seg over seks tiår. Han spilte hovedrollen i over 100 filmer og TV-serier, og han var en elsket figur i Hollywood.