Ugjengjeldt kjærlighet er et tilbakevendende tema i stykket, ettersom flere karakterer er forelsket i noen som ikke gir tilbake kjærligheten. For eksempel er Viola forelsket i Duke Orsino, som er forelsket i Olivia. Olivia er på sin side forelsket i Cesario (som faktisk er Viola i forkledning). Dette skaper et komplekst nett av ulykkelig kjærlighet som driver mye av stykkets handling og humor.
Feilaktig identitet er også et sentralt trekk ved stykket. Viola forkler seg som en mann ved navn Cesario for å gå inn i Orsinos tjeneste. Denne forkledningen fører til en rekke misforståelser og komplikasjoner, ettersom andre karakterer tar Viola for å være en mann og blir forelsket i henne. Den feilaktige identiteten skaper også muligheter for Viola til å observere og kommentere de andre karakterene, noe som bidrar til stykkets humor.
Totalt sett er ulykkelig kjærlighet og feilaktig identitet to nøkkeltrekk som bidrar til humoren og kompleksiteten til Twelfth Night.